Diana dilahirkan Diana Frances Spencer, anak bongsu kepada Edward Spencer, Viscount Althorp, dan isteri pertamanya, Frances Spencer, Viscountess Althorp di Park House, Sandringham Estate. Beliau dibaptiskan di Gereja St. Mary Magdalene di Sandringham, oleh Percy Herbert (rektor gereja dan bekas biskop Norwich dan Blackburn); ibu bapa pembaptisannya ialah John Floyd dan Mary Colman (seorang anak saudara Elizabeth, Ibu Ratu).

Diana mempunyai latarbelakang keluarga diraja dan bangsawan. Di sebelah ibunya, Diana mempunyai darah orang Amerika. Moyang Diana merupakan seorang wanita dari keluarga berada dari Amerika, Frances Works. Di sebelah bapanya, Diana merupakan keturunan langsung Raja Charles II melalui dua anak lelaki yang luar nikah dan menerusi Raja James II melalui seorang anak perempuannya yang luar nikah. Menurut penyusun biografi Diana, Lady Colin Campbell, moyang kepada moyang Diana, Eliza Kewark (beberapa sumber mengeja nama Kewark sebagai "Kevork" atau "Kevorkian") berasal dari Bombay, India dan kemungkinan keturunan orang India, walaupun keluarga Diana sering mengatakan yang keluarga "Kevork/Kewark" adalah dari Armenia.

Setelah perceraian ibu bapanya, Diana telah dijaga oleh bapanya. Dengan kematiannya datuk di sebelah bapa, Albert Spencer pada 1975, bapa Diana menjadi Earl Spencer ke-8 dan Diana diberi gelaran Lady Diana Spencer dan berpindah dari rumah kanak-kanaknya di Park House ke rumah keluarga besar mereka di Althorp. Setahun kemudian, bapanya berkahwin dengan Raine, Countess Dartmouth, anak perempuan kepada novelis romantik, Barbara Cartland.

Pendidikan

Diana menerima pendidikannya di Riddlesworth Hall di Norfolk dan di West Heath Girls' School, di Sevenoaks, Kent, di mana beliau dianggap sebagai seorang pelajar berprestasi rendah. Diana juga telah gagal dalam peperiksaan O-levelnya. Pada 1977, semasa berusia 16 tahun, Diana meninggalkan sekolah West Heath untuk menuntut di Institut Alpin Videmanette di Switzerland, sebuah sekolah yang menitikberatkan pendidikan budaya dan menyediakan pelajar-pelajarnya untuk aktiviti-aktiviti sosial. Di situ juga, Diana telah berkenalan dengan bakal suaminya yang pada masa itu sedang keluar dengan kakaknya, Lady Sarah. Walaupun Diana tidak cemerlang dalam pelajarannya, beliau lebih terserlah dalam bidang sukan dan juga merupakan seorang penyanyi amateur yang baik.